Рекомендация
Студентам
Вы можете использовать данную статью как часть или основу своего реферата или даже дипломной работы или своего сайта
Просто перейдите по ссылке ниже, редактируйте статью, все картинки тоже доступны, все бесплатно
Редактировать статью?!
Скачать статью в формате PDF
Сохраните результат в MS Word Docx или PDF, делитесь с друзьями, спасибо :)
Категории статей
Причины ограниченной эффективности противоопухолевой терапии с позиций клеточной биологии
В работе кратко проанализированы молекулярные механизмы становления и обеспечения фенотипа множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Лекарственная устойчивость клеток может быть связана с высокой активностью системы детоксикации противоопухолевых лекарств, с высокой функцией молекулярных насосов, выбрасывающих лекарственные вещества из клетки, а также с репрессией программы клеточной гибели, обеспечивающей клеточный гомеостаз и генетическую стабильность организма. Репрессия программы клеточной гибели может происходить в результате естественной прогрессии опухоли и приводит к формированию фенотипа ее множественной лекарственной устойчивости.
Ключевые слова: программированная гибель клеток, множественная лекарственная устойчивость, опухолевые клетки.
Химиотерапия является основным, а при некоторых формах и стадиях распространения единственным методом лечения онкологических заболеваний. Несмотря на расширяющийся арсенал противоопухолевых лекарственных средств, современное состояние консервативных методов лечения злокачественных опухолей далеко от совершенства. Наиболее серьезным препятствием к повышению эффективности специфической терапии опухолей по-прежнему остается фенотип их множественной лекарственной устойчивости (МЛУ), который не только формируется в процессе предшествующего лечения онкологических больных, но и возникает в ряде случаев спонтанно, в результате индивидуальных особенностей опухолевой прогрессии у пациентов, ранее не получавших противоопухолевой терапии.
Вместе с тем молекулярные механизмы становления и обеспечения фенотипа МЛУ опухолей во многом связаны с биологическими особенностями опухолевых клеток.
Подавляющее большинство современных противоопухолевых природных и синтетических химических соединений действуют на клетки-мишени непосредственно, проникая в них и поражая многообразные внутриклеточные молекулярные мишени. Однако путь лекарственного вещества от фабричной упаковки до опухолевой ткани вовсе не усыпан розами: на этом пути армия лекарственных молекул несет значительные потери. Попав в кровь, лекарственные соединения могут связываться с компонентами плазмы, подвергаться окислительному катаболизму в печени, выводиться из организма почками, хотя бы раз преодолев гистогематический барьер, накапливаться в тканях, в т. ч. в нормальных. В итоге до опухолевой ткани добирается лишь часть введенного в организм лекарства. Величина этой части зависит от разнообразных факторов, определяющих в совокупности особенности фармакокинетики конкретного лекарственного препарата и биодоступности для лекарств конкретной опухоли. Проблемы распределения лекарств в органах и тканях организма не являются предметом настоящей статьи, хотя они могут сами по себе влиять на лекарственную чувствительность опухолей за счет ограничения доступности опухолевой ткани для лекарств, быстрой их детоксикации/дезактивации и др. Отметим лишь, что набирающая в последние годы популярность антиан-гиогенная терапия онкологических заболеваний может усугубить и без того незавидное состояние циторедуктивной химиотерапии. Итак, часть введенного в организм онкологического больного лекарственного вещества попала в ткань опухоли и проникла в опухолевые клетки. С этого момента все дальнейшие события подчиняются законам клеточной биологии: опухоль, состоящая из чувствительных к химиотерапевтическим средствам клеток, может оказаться рефрактерной к лечению по упомянутым выше причинам; состоящая из резистентных клеток опухоль не может быть чувствительна к терапевтическому лечению ни при каких условиях.
Становлению фенотипа лекарственной устойчивости в значительной степени способствует применение циторедуктивной химиотерапии. В начале 80-х г прошлого столетия Банк опухолевых штаммов и клеточных культур Российского (в то время — Всесоюзного) онкологического научного центра им. Н. Н. Блохина РАМН изобиловал модельными штаммами перевиваемых опухолей животных с индуцированной устойчивостью к одному или нескольким лекарственным противоопухолевым препаратам. Способ получения этих штаммов стандартен: индукции резистентности добивались хроническим применением субтерапевтических доз цитостатика на протяжении нескольких десятков пассажей опухолевых клеток in vivo или in vitro. Результатом явилась коллекция вариантов стандартных перевиваемых опухолевых штаммов с индуцированной резистентностью к вызвавшему ее агенту. Достаточно часто такая резистентность сопровождается развитием устойчивости и к другим, близким по структуре препаратам того же класса, не применявшимся для индукции, — перекрестная (кросс-) резистентность.
Значительно серьезнее, с точки зрения клинической химиотерапии опухолевых заболеваний, выглядит фенотип МЛУ опухолевых клеток — развитие резистентности сразу к большому числу противоопухолевых лекарств с совершенно не похожими друг на друга структурами и механизмами действия: антрациклиновым антибиотикам, алкалоидам барвинка, метотрексату, эпиподофиллотоксинам и др. В настоящее время известно и достаточно подробно изучено по крайней мере несколько молекулярно-биологических механизмов обеспечения фенотипа МЛУ: активация энергозависимого обратного транспорта (выброса) лекарственных веществ из клетки, стимуляция системы внутриклеточной детоксикации и усиление процессов репарации внутриклеточных повреждений [10, И].
Первый механизм обеспечивается гиперфункцией АТР-зависимых транспортеров (АВС-транспортеры, от англ. ATP-binding cassette), наиболее исследованными из которых являются мембраносвязанные переносчики Р-гликопротеин (Pgp, Р-170) — продукт гена MDR1 (Multidrug Resistance l), MRP 1-7 (MDR associated protein) и BCRP (Breast cancer resistance associated protein), осуществляющие выброс проникших в цитоплазму ксенобиотиков в межклеточное пространство, а также цитозольные белки LRP/MVP (Lung resistance related protein/Major vaults protein), секвестрирующие внутриклеточное распределение цитотоксинов и иммобилизующие их из цитоплазмы в рибонуклеопроте-идные везикулы (от англ, vault — склеп), основным компонентом которых они и являются. Иммобилизованные в такие везикулы лекарства в последующем выталкиваются из клетки. Система внутриклеточной детоксикации и катаболизма лекарств использует реакцию связывания последних с глутатионом (GSH) и обеспечивается активностью ферментов семейства глутатион-8-трансфераз (GSTs) и глутатион-редуктазы. Конъюгаты противоопухолевых препаратов (в основном — алкилирую-щих агентов и комплексных соединений платины, активно атакующих SH-rpynny глутатиона) выбрасываются из клетки обратными транспортерами GS-X, к числу которых принадлежит и упомянутый выше MRP. Семейство GSTs составляет несколько различных изоферментов, роль каждого из которых в детоксикации различных ксенобиотиков неодинакова, но, например, повышение активности GSTrc часто обнаруживается в клетках с гиперэкспрессией Pgp [10], что говорит о возможности сосуществования в клетках нескольких уровней защиты одновременно. Репарация поврежденных биомакромолекул осуществляется несколькими ферментными системами, участвующими в эксцизионной репарации ДНК, удалении спаренных и поврежденных оснований, репарации разрывов ДНК, рефолдинге (ренатурации) и убик-витинзависимой деградации в протеасомах денатурированных белковых молекул. МЛУ, обусловленная повышенным уровнем активности репаративных процессов, касается в основном соединений алкилирующего действия и сходных по механизмам первичного повреждения препаратов платины. Считают, что перечень химиотерапевтических препаратов, устойчивость к которым определяется повышенной функцией репарации биомакромолекул, значительно меньше, чем список агентов, активно выбрасывающихся из клетки посредством ABC- и LRP/MVP-транспортеров [10].
Описанные выше уровни защиты клеток от повреждающего (потенциально — генотоксического) действия биологически агрессивных химических соединений достаточно эффективно предотвращают ка- тастрофические для клетки-мишени последствия применения противоопухолевых химиотерапевтичес-ких средств, хотя эволюционно возникли задолго до появления химиотерапии. Природной функцией этих систем является предотвращение опасного влияния агрессивной внешней среды обитания. В этой связи наибольшего развития подобные системы жизнеобеспечения достигли в тканях, потенциально наиболее подверженных атаке со стороны внешних факторов, — в эпителии легких и желудочно-кишечного тракта.
Видимо, именно естественным предназначением системы клеточной детоксикации объясняется стрес-сорно-индуцируемый, адаптационный механизм становления МЛУ такого типа. Гиперфункция обратных транспортеров представляет собой стабильно наследуемую эпигенетическую активацию соответствующих ферментных систем в ответ на не специфическую, но потенциально опасную для жизни клетки экспансию факторов внешней среды: гипертермию, гиперосмию, присутствие солей тяжелых металлов, УФ-облу-чение [10, 13]. Потенциальная ущербность подобной стратегии защиты очевидна: энергозатратный механизм функционирования и определенный лимит исполнительных молекулярных машин — соответствующих белков — определяют общий ресурс адаптационных возможностей клетки-мишени.
По сути такие механизмы обеспечения МЛУ подобны действиям защитников осажденной крепости, сопротивление которых может быть достаточно упорным, но которое часто удается сломить с помощью некоторых тактических военных приемов: усиление штурмового натиска (высокодозная химиотерапия);
использование пятой колонны (применение ингибиторов активности белков-транспортеров); применение тяжелой осадной артиллерии (липосомальные средства доставки, локальная гипертермия
и др.).
Успех этих мероприятий явится триумфом нападающего (врача-онколога) и катастрофой обороняющегося (опухолевой клетки).
В дополнение к описанному обнаружено, что устойчивость к отдельным группам противоопухолевых химиотерапевтических препаратов может быть обусловлена изменением свойств их молекулярной мишени (в частности, топоизомераз I и II при развитии ре-зистентности к эпиподофиллотоксинам, митоксантрону, камптотецину, антрациклиновым антибиотикам) или использованием клеткой альтернативных метаболических путей биосинтеза жизненно необходимых субстратов: переключение акцента с тимидилат-синтетазной реакции образования dTMP из dUMP (синтез de novo) на спасательный путь реутилизации TdR и фос-форилирования его в dTMP тимидинкиназой при развитии резистентности к фторпиримидинам [7]. Резистентность подобного типа, скорее всего, является следствием селективной смены клеточной популяции, при которой клетки, экспрессирующие соответствующие не поражаемые мишени либо вовсе обходящиеся без таких мишеней, получают преимущество в выживании.
Все описанные выше механизмы обеспечения фенотипа лекарственной устойчивости так или иначе преследуют одну цель: они направлены на предотвращение взаимодействия цитотоксина с внутриклеточной мишенью и/или на скорейшую ликвидацию последствий такого взаимодействия. Возможен ли какой-либо иной, принципиально отличный от описанных и универсальный способ поддержания фенотипа МЛУ? Ответ на этот вопрос зависит от наших представлений о механизмах цитотоксичности противоопухолевых лекарств.
Традиционно цитотоксический эффект подавляющего большинства противоопухолевых препаратов связывали с индукцией не совместимых с жизнью необратимых химических повреждений биомакромолекул клеток-мишеней, в первую очередь, нуклеиновых кислот и белков. Поиск новых внутриклеточных мишеней химиотерапевтических агентов значительно продвинул фундаментальные представления о молекулярной структуре и биологических функциях субклеточных органелл, в первую очередь, клеточного ядра, но вместе с тем не дал исчерпывающего объяснения механизмов цитотоксичности противоопухолевых лекарств.
Объяснение многим обнаруженным фактам было найдено в связи с интенсивным изучением в последнее десятилетие феномена программированной гибели клеток (ПГК). Открытый в начале 70-х г прошлого века процесс последовательного саморазрушения тимоцитов, пораженных ионизирующим облучением или действием глюкокортикоидов [18, 19], долгое время рассматривался исключительно как уникальный механизм интерфазной гибели клеток лимфоидной ткани. Позднее было продемонстрировано глобальное значение процесса ПГК для онто- и филогенеза, возникновения органной и тканевой специфичности, процессов эволюции, дифференцировки, специфической реакции на внешние воздействия и др.
В научной литературе термин ПГК часто отождествляют с апоптозом, что не совсем верно: апоптоз является лишь частным случаем осуществления ПГК, сочетающим определенные морфологические проявления этого процесса. Не во всех случаях программированной гибели наблюдаются характерные для апоп-тоза морфологические изменения клеток, однако важен сам факт программированности процесса гибели, его активного характера.
Тканевый гомеостаз многоклеточных организмов обеспечивается одновременным функционированием двух разнонаправленных процессов контролируемой пролиферацией и ПГК. С помощью контролируемой пролиферации происходит постоянное обновление и замещение утраченных тканей, клональная амплификация специализированных иммунокомпетентных клеток. Посредством ПГК элиминируются состарившиеся, поврежденные или инфицированные клетки (уме- стно использовать термин «санитарная функция» ПГК), а также клетки, потребность в которых в данный момент жизнедеятельности организма отпала (инструктивная функция ПГК).
В нормальных клетках организма конститутивно присутствуют все необходимые для осуществления ПГК компоненты. Вне апоптогенных стимулов они находятся в латентном состоянии и могут в течение длительного времени не востребоваться клеткой, но на протяжении всей ее жизни суицидный аппарат готов к немедленному и необратимому использованию. Активация ПГК происходит на посттрансляционном уровне даже в условиях подавления транскрипции и белкового синтеза. Сигналом к активации ПГК может служить любое потенциально опасное для дальнейшей жизнедеятельности клетки повреждение, однако такой сигнал не подлежит немедленному исполнению: учитывая необратимость фатального решения, он подвергается всестороннему анализу на соответствие другим сигналам, постоянно получаемым клетками. Активации ПГК противостоит система выживания, вследствие чего процесс принятия решения находится в прямой зависимости от баланса сигналов смерти/выживания [4, 16].
Наличие в клетках такого сформированного суицидного аппарата делает весьма привлекательной перспективу его использования в целях циторедуктивной терапии онкологических заболеваний. Однако оказалось, что эта заманчивая перспектива уже более полувека используется в онкологической клинике: практически все противоопухолевые лекарственные средства — от препаратов первой волны (эмбихин, 5-фторурацил, хлорамбуцил) до современных (гемзар, флудара, паклитаксел, гливек, ритуксимаб) и даже перспективных (TRAIL, ET-I8-OCH3) — являются активаторами ПГК [17]. Правда, потребовалось около 30 лет для формирования концепции, согласно которой активация программы гибели опухолевых клеток является целью использования цитотоксических противоопухолевых препаратов, а не побочным или сопутствующим их применению явлением. Принципиальным в этой концепции является признание того факта, что цитотоксины не убивают клетки-мишени, а провоцируют их на совершение суицидного акта [5].
Последовательность событий, происходящих в пораженной цитотоксическими соединениями делящейся клетке, может быть представлена следующей общей схемой:
индукция первичных повреждений биомакромолекул и органелл —> стрессовая реакция (адаптационный синдром) -> временная остановка деления -> репарация повреждений, активация систем выживания в агрессивных условиях -> ?
Значение последнего звена (?) зависит от многих причин, в первую очередь, от успеха репаративных процессов и полноценности системы контроля за состоянием собственного генома: либо клетка, восстановив повреждения, продолжит репродуктивный цикл; либо произойдет необратимый (по крайней мере, длительный) арест ее деления; либо будет активирована ПГК с ее закономерным финалом.
Остановка клеточного деления, репарация повреждений и, в случае ее незавершенности, гибель характерны для клеток нормальных тканей, с чем связана побочная токсичность противоопухолевой терапии, а также для трансформированных клеток высокой степени дифференцировки сохраняющих чувствительность к химиотерапевтическим средствам и ионизирующему облучению.
Однако по мере прогрессии опухоли в отдельных опухолевых клетках генетически заложенная программа гибели может ломаться. Такая поломка может явиться следствием дефицита ключевых исполнительных механизмов ПГК, гиперэкспрессии или гиперфункции факторов системы выживания, несогласованности сигнальных путей гибели/выживания и многих других причин, природу которых в каждом конкретном случае можно знать или не знать — биологические последствия от этого не изменятся: клетка с поломанной или утраченной программой гибели перестает адекватно реагировать на наличие в ней повреждений и приобретает фенотип МЛУ. Материальным подтверждением такого теоретического заключения явилась полученная нами мультирезистентная к разнообразным индукторам апоптоза линия клеток А4 [3, 9]. Утрата этими клетками способности к активации и/или исполнению ПГК сопровождается фенотипом их МЛУ [6, 15].
В такой ситуации при индукции нерепарабельных (или не репарируемых?) повреждений в зависимости от уровня, но котором сигнальный путь ПГК заблокирован, суицидный механизм либо вовсе не может быть включен, либо процесс самоликвидации не может быть доведен до конца — до формирования апоптоз-ных тел.
Если включившийся механизм ПГК вызвал процесс деградации хроматина, а завершение ПГК по морфотипу апоптоза в силу каких-то причин невозможно, клетка обречена на гибель с проявлениями некротического морфотипа (атипичный апоптоз, некро-зоподобная программированная гибель). Если же формирования сигнала ПГК не происходит вовсе либо этот сигнал формируется, но не вызывает активации эффекторного звена ПГК, дальнейшая судьба клетки может иметь два варианта развития. Первый связан с необратимым или, по крайней мере, длительным арестом делящейся клетки в одной из фаз клеточного цикла. Такой исход с точки зрения химиотерапии онкологических заболеваний можно считать благоприятным, поскольку опухолевая клетка, сохраняя жизнеспособность настолько, насколько это ей позволяет сумма внутриклеточных повреждений, тем не менее утрачивает свою репродуктивную функцию. В такой ситуации циторедуктивное действие химиотерапии вырождается до цитостатического, что клинически констатируется в форме стабилизации опухолевого процесса. Второй вариант связан с полным игнорированием клеткой-мишенью повреждений, в т. ч. генетических, в результате чего она не подвергается интерфазной гибели, а продолжает цикл деления. Соматические мутации, возникшие в таких клетках, в последующих поколениях проявятся дестабилизацией генома и клональ-ным расщеплением клеточной популяции. Если в таких клетках осуществляется асимметричный митоз, в результате которого дочерние клетки оказываются генетически неравноценными, то судьба их потомков неодинакова. Неравномерное распределение генетического материала (анеуплоидия) приведет к появлению дочерней клетки с недостаточным содержанием ДНК (гиподиплоидной) и ее антипода — гипердиплоидной клетки. Первая является неполноценной, а при значительной потере генетического материала — нежизнеспособной. Зато вторая имеет полный набор ДНК и еще некоторый ее излишек, который может никак не влиять на ее жизнедеятельность и пролиферацию, но служит верным признаком происхождения будущего клона из клетки с подавленной функцией генетического самоконтроля и программированной гибели. Появление анеуплоидного клона опухолевых клеток является прогностически неблагоприятным признаком опухолевого процесса любой локализации [8] и свидетельствует о химио- и радиорезистентности опухоли.
Если способность опухолевых клеток к индукции собственной ПГК настолько важна для достижения положительного результата циторедуктивной терапии опухолевых заболеваний, то проспективная оценка этой способности могла бы помочь в выборе оптимальной тактики лечения. Поиск адекватного критерия полноценности аппарата ПГК в опухолях ведется более 10 лет как с использованием экспериментальных опухолевых моделей (клеточные линии различного гистогенеза и степени дифференцировки, генетически модифицированные клональные линии, лабораторные животные с искусственно активированными и, напротив, нокаутированными отдельными генами), так и на клинически полученном материале опухолевой ткани (биоптат, хирургически удаленная опухоль, периферическая кровь и костный мозг онкогематоло-гических больных) [1, 22]. В большинстве случаев проводят анализ уровня экспрессии и наличия инакти-вирующих мутаций гена р53; уровень экспрессии про-и антиапоптогенных белков Bel2, Bel-XL, Bax, Bad, Bak; наличие мембранных рецепторов смерти CD95 и TNFR-1; уровень активности МАР-киназ. До сих пор не обнаружен прогностически значимый маркер способности опухолевой клетки ответить на апоптоген-ный стимул совершением суицидного акта.
По всей видимости, такой маркер и не будет найден, поскольку его не существует. Успехи, достигнутые за последние несколько лет в исследованиях клеточных сигнальных путей, вскрыли необычайную сложность организации внутриклеточных коммуникационных систем, а существование полифункциональности многих ферментов (особенно компонентов сигнальных путей) объясняет многообразие клеточных реакций на сходные по природе стимулы и, напротив, различные ответы (вплоть до противоположных) на стимулы одного происхождения [4]. Регулируемая полифункциональность «молекулярных машин» и столь же управляемая компартментализация клеточного пространства позволяет клетке эксплуатировать минимальный ассортимент регуляторных белков с максимальной эффективностью [2].
Вычленение отдельного компонента или даже локального участка сигнальной цепи не может дать представления о работе всей системы в совокупности. Еще очень много загадок клеточной и молекулярной биологии придется разгадать, прежде, чем придет хотя бы приблизительное понимание секретов функционирования молекулярной «кухни». Тем не менее определенные практические выводы можно сделать и до выяснения всех тонкостей проблемы.
В последнее время серьезно обсуждается новое перспективное направление в клинической биотерапии злокачественных опухолей — использование ци-тотоксического потенциала агонистических монокло-нальных антител (аг-МКА) к рецепторам смерти и ре-комбинантных аналогов их природных лигандов [12, 14, 20, 21]. Действительно, использование аг-МКА к рецептору CD95/Fas/APO-l (клон IPO-4) вызывает высокоэффективную деплецию антиген-позитивной популяции опухолевых клеток, но именно таким воздействием нами получен упоминавшийся выше кло-нальный вариант А4 линии Jurkat [3, 9]: выжившая в результате такой селекции фракция С095-негатив-ных клеток приобрела 20-200-кратную резистент-ность к широкому спектру противоопухолевых лекарств и цитотоксинов. Сам факт существования клеток А4 является сигналом возможной серьезной опасности на пути клинического использования подобных биопрепаратов.
С другой стороны, методика получения мультире-зистентной линии А4 хронической стимуляцией рецептора смерти аналогом природного лиганда и совокупность ее свойств, соответствующая фенотипу МЛУ, позволила сделать три важных заключения.
Репрессия или ликвидация опухолевой клеткой собственных апоптогенных сигнальных путей приводит к приобретению способности не вступать в интерфазную гибель при субнекротических повреждениях. Этот отчаянный шаг позволяет клетке пережить цитотоксическое воздействие ценой разрушения аппарата контроля и поддержания генетической стабильности: в дальнейшем клетки с повреждениями в молекуле ДНК будут не способны к самоликвидации и послужат основой для формирования полиморфной опухолевой популяции. На этом этапе прогрессии опухоли возможности современной циторедуктивной химио-, радио- и биотерапии можно считать исчерпанными. Подобный механизм формирования фенотипа МЛУ может происходить без участия химиотерапевти-ческих противоопухолевых препаратов. Поскольку метод получения линии А4 в какой-то мере моделирует процесс цитотоксического контроля за популяцией опухолевых клеток со стороны систем противоопухолевого иммунитета, весьма вероятно, что полученный результат представляет собой один из механизмов становления фенотипа МЛУ и прогрессии опухоли в случаях ранее не леченных опухолевых заболеваний.
Возможности подавляющего большинства (если не всех) противоопухолевых лекарственных средств ограничены их способностью активировать процесс ПГК. Клетки, по той или иной причине утратившие или репрессировавшие программу собственной гибели, перестают быть мишенями для средств современной химиотерапии. Такое положение является прямым следствием использования существующей до настоящего времени системы отбора химических соединений с потенциальной противоопухолевой активностью. Первоначально отобранные в результате цитотоксического скрининга на опухолевых моделях с функционирующим аппаратом ПГК, эти соединения оказываются бессильными при его репрессии. Вероятно, поиск лекарственных средств новых поколений следует строить на иных принципах отбора соединений и с иной концепцией контролируемого влияния на опухолевые клетки. Какой станет химиотерапия наступившего нового столетия и к каким результатам это приведет, покажет будущее.
Источник: stomfak.ru
